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Ambrosius Holbein (* um 1494 in Augsburg; † nach 1519 in Basel) war ein deutsch-schweizerischer Maler und Grafiker.
Ambrosius Holbein war ein Sohn von Hans Holbein d. Ä. und der ältere Bruder von Hans Holbein d. J. Seine Ausbildung erhielt er vermutlich in der Werkstatt des Vaters. Ab 1515 war er möglicherweise in Stein am Rhein tätig. Nach 1516 ist seine Anwesenheit in Basel nachweisbar, wo er 1517 in die Malerzunft Zum Himmel eintrat und 1518 das Bürgerrecht erwarb.