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Der Highway 401 oder Macdonald-Cartier Freeway ist eine Autobahn, die sich durch den Süden der kanadischen Provinz Ontario zieht. Sie ist die bei weitem längste Autobahn der 400er-Serie in Ontario und eine der meistbefahrenen Autobahnen der Welt. Sie hat an ihrer breitesten Stelle 18 Fahrstreifen. Zusammen mit der Autoroute 20 in Québec bildet sie das Haupttransportnetz des Québec-Windsor-Korridors, der am dichtesten besiedelten, wohlhabendsten und meist industrialisierten Region des Landes, die sich entlang des Sankt-Lorenz-Stroms erstreckt und in der über die Hälfte der kanadischen Bevölkerung wohnen und drei der größten kanadischen Städte, nämlich Québec, Montreal und Toronto, liegen.
1965 benannte der Premier Ontarios, John Robarts, den Highway 401 zu Ehren der beiden Väter der Konföderation, Sir John Macdonald und Sir George-Étienne Cartier Macdonald-Cartier Freeway. Dies ist der in offiziellen Dokumenten gebräuchliche Name, der jedoch selten auf Straßenschildern oder in Unterhaltungen gebraucht wird.