Kofaktori on orgaaninen molekyyli tai ioni, joka entsyymin täytyy sitoa itseensä suorittaakseen itselleen ominaisia katalyyttisiä kemiallisia reaktioita. Entsyymin ja kofaktorin välinen sidos voi olla heikko sidos tai kovalenttinen sidos. Kovalenttisesti sitoutuvaa kofaktoria voidaan kutsua prosteettiseksi ryhmäksi.[1]
IUPAC:n määritelmän mukaan orgaaninen molekyyli ei voi olla aminohappo, peptidi tai proteiini, jotta se voidaan luokitella kofaktoriksi. Molekyyliä voidaan kutsua paitsi kofaktoriksi, myös koentsyymiksi.[2] Monet koentsyymeistä ovat vitamiineja tai näiden johdannaisia, mutta eivät aina.
Kofaktori-ioni taas on tavallisesti metalli-ioni,[1] kuten Mn2+, Mg2+ tai Zn2+.[3]
Entsyymi, johon ei ole sitoutunut sen luontaista kofaktoria tai kofaktoreita on apoentsyymi, joka on toimimaton. Näitä sitova entsyymi on holoentsyymi, joka on toimiva.[2]
Kofaktori on yleensä entsyymin katalyyttisessä keskuksessa, eli siinä kohtaa, jossa entsyymin suorittamat kemialliset reaktiot tapahtuvat.
Jotkin entsyymit tarvitsevat useamman kofaktorin. Pyruvaattidehydrogenaasikompleksi on kolmen entsyymin kokonaisuus, joka tarvitsee kofaktoreiksi NAD+-, tiamiinipyrofosfaatti-, lipoaatti- ja koentsyymi A -molekyylit.[3]