Kromatografi lapisan tipis (disingkat KLT) adalah suatu teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan campuran yang tidak volatil.[1] Kromatografi lapisan tipis dilakukan pada selembar kaca, plastik, atau aluminium foil yang dilapisi dengan lapisan tipis bahan adsorben, biasanya silika gel, aluminium oksida, atau selulosa. Lapisan tipis adsorben diketahui sebagai fasa stasioner (atau fasa diam).
Setelah sampel diaplikasikan pada pelat, suatu pelarut atau campuran pelarut (dikenal sebagai fasa gerak) dialirkan ke atas melalui pelat berdasarkan gaya kapilaritas. Oleh karena analit yang berbeda mengalir menaiki pelat KLT dengan laju yang berbeda, maka terjadilah pemisahan komponen dalam analit tsb.[2]
Kromatografi lapisan tipis dapat digunakan untuk memonitor pergerakan reaksi, mengidentifikasi senyawa yang terdapat di dalam campuran, dan menentukan kemurnian bahan. Contoh penggunaan aplikasi ini antara lain: analisis seramida dan asam lemak, deteksi pestisida dan insektisida dalam air dan makanan, analisis komposisi zat warna serat dalam bidang forensik, penentuan kemurnian radiokimia dalam bidang radiofarmasi, atau identifikasi tanaman obat dan konstituennya.[3]
Sejumlah pengayaan telah dilakukan terhadap metode aslinya hingga otomasi tahapan yang berbeda, untuk meningkatkan resolusi yang diperoleh menggunakan KLT dan memungkinkan untuk melakukan analisis kuantitatif yang lebih akurat. Metode ini dikenal sebagai KLTKT, atau "KLT kinerja tinggi"