De Tolhuissluis is een schutsluis in Nederland op de grens van de provincies Zuid-Holland en Noord-Holland, die het Amstel-Drechtkanaal verbindt met de Drecht en het Aarkanaal. De sluis ligt bij Nieuwveen maar op het grondgebied van de gemeente Uithoorn.
De sluis is in 1823 gebouwd op initiatief van koning Willem I, in het kader van het voor grotere schepen bevaarbaar maken van de Amstel, de Drecht en het Aarkanaal. De sluis verving de sluizen aan de Bilderdam en bij de Kattenbrug en overbrugde het peilverschil tussen de toenmalige Hoogheemraadschappen Rijnland en Amstelland.
Het Tolhuis lag vanouds in Calslagen (Kalslagen). Sinds het verleggen van de provinciegrens en de verdeling van het voormalige ambacht in 1864 behoort het bij Uithoorn.