Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Wysokosprawna chromatografia cieczowa, HPLC (ang. high-performance liquid chromatography) – odmiana chromatografii cieczowej, technika analityczna a także preparatywna, stosowana do oczyszczania, badania czystości oraz identyfikacji związków chemicznych.

Jest to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Oznacza to, że analizowana próbka jest rozpuszczana w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku, zależnym od właściwości substancji i zastosowanego układu, a następnie taki roztwór jest kierowany na kolumnę, która wypełniona jest odpowiednio dobranym złożem porowatym lub żelowym. Rolę cieczy nośnej (fazy ruchomej) pełni odpowiednio dobrana mieszanina (tzw. eluent)^[1]. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi będącymi składnikami analizowanej próbki a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. W zależności od zastosowanego układu można wyróżnić kilka mechanizmów retencji, np. te związki chemiczne, które silniej oddziałują ze złożem (mają tzw. większe powinowactwo do złoża) a słabiej z fazą ruchomą, przepływają wolniej przez kolumnę, zaś związki chemiczne, które oddziałują słabiej ze złożem a silniej z fazą ruchomą przepływają szybciej. W pewnych specyficznych układach HPLC mechanizmy retencji są jednak bardziej złożone.

HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim podawany jest eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, kilkadziesiąt atm, w części przypadków przekraczające 100 atm. Wysokie ciśnienie w układzie HPLC wynika z budowy pomp HPLC (wąskie przekroje kapilar), uziarnienia wypełnienia kolumn (kilka mikrometrów) i przepływu fazy ruchomej stosowanego w aplikacji(od ułamków ml/min do nawet kilkudziesięciu ml/min w przypadku chromatografii preparatywnej). Drobne uziarnienia złoża fazy stacjonarnej skutkuje korzystniejszymi parametrami sprawności i rozdzielczości układu HPLC, dzięki czemu uzyskujemy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne w znacznie krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu eluentu i mniejszej ilości analizowanej próbki niż w klasycznej chromatografii kolumnowej. Zdolności rozdzielcze współczesnych aparatów i kolumn HPLC są niekiedy porównywalne do zdolności rozdzielczych chromatografii gazowej.

W HPLC duże znaczenie dla rozdziału ma polarność faz. Początkowo stosowano normalny układ faz (NP, normal phase), w którym faza stacjonarna jest znacznie bardziej polarna niż faza ruchoma (Np. układ: żel krzemionkowy – heksan). Obecnie najczęściej stosuje się odwrócony układ faz (RP, reverse phase – układ faz odwróconych), w którym faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, np. układ: żel krzemionkowy z chemicznie modyfikowaną powierzchnią (grupy oktadecylosilanowe, oktylosilanowe, diole, podstawniki modyfikowane i inne, bardziej złożone) – mieszanina metanolu, acetonitrylu, wody, specjalnie dobranych buforów itp. Podział zależy od wiązania się hydrofobowych cząsteczek substancji rozpuszczonej z fazy ruchomej do unieruchomionych, hydrofobowych ligandów związanych z fazą stacjonarną. Siła i charakter oddziaływania między cząsteczkami próbki i fazą stacjonarną zależy zarówno od oddziaływań hydrofobowych, jak i oddziaływań polarnych. Substancje rozpuszczone są wymywane w kolejności rosnącej molekularnej hydrofobowości. Układy RP mają bardziej trwałe wypełnienia, cechują się niższym kosztem fazy ruchomej, a przede wszystkim cechują się inną selektywnością niż układy NP, co wykorzystuje się w analizie próbek o dużej rozpiętości polarności komponentów.